帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是发病率仅次于阿尔茨海默病的神经退行性疾病，以其在老年人群中的高发性和对社会的危害性而倍受关注，主要体现为震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势反射障碍等，严重影响患者的生活能力[1-2]。PD确切的致病机制尚不明确，随着对PD致病机制的不断探索，线粒体功能障碍与氧化应激学说已逐渐证实在PD的发生和发展中扮演者重要角色，抑制PD模型中的线粒体功能损伤与氧化应激已成为当前抵抗PD的重要策略[3-5]。目前临床对于PD的治疗主要采取对症治疗，当下复方左旋多巴（levodopa，L-DOPA）为治疗PD的最佳方案，但由于其严重的不良反应，给PD的药物治疗前景蒙上了阴影[6]。因此，探寻不良反应小的有效治疗药物已成为PD研究的首要问题。

  中药资源丰富，从天然产物中筛选出疗效确切、安全无毒防治 PD 的药物具有得天独厚的优势 [7] 。人参皂苷 Re 作为“百草之王”人参 Panax ginseng C. A. Mey. 中重要的活性成分，属于四环三萜类衍生物，已被证明具有突出的神经保护作用。据报道，人参皂苷 Re 对 1- 甲基 -4- 苯基 -1,2,3,6- 四氢吡啶（ 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine ， MPTP ）阳离子诱导的人骨髓神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞损伤有着非常明显的保护作用，人参皂苷 Re 也可挽救 PTEN 诱导性激酶蛋白 -1 （ PTEN induced putative kinase-1 ， Pink-1 ）特异性缺失导致的线粒体电子传递链复合物 IV 活力改变，人参皂苷 Re 还可逆转 PD 小鼠多巴胺神经元凋亡一系列调控基因和蛋白的异常表达来实现多巴胺神经元的保护作用，如减少诱导型一氧化氮合酶（ inducible nitric oxide synthase ， iNOS ），由此减少一氧化氮（ nitric oxide ， NO ）的生成，下调 PD 小鼠黑质部促凋亡蛋白 p53 的表达，抑制 MPTP 诱导小鼠黑质星形胶质细胞增生、调节脑内阿片肽和抗黑质多巴胺能神经元凋亡等 [8-11] 。课题组前期已对人参皂苷 Re 在 PD 发生及发展过程中的作用途径进行了初步探索 [12] ，本研究旨在深入剖析人参皂苷 Re 潜在的神经保护作用途径及作用机制，为人参类中药防治 PD 供科学依据。

  取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 2 × 104/ 孔接种于 96 孔板，待其融合度达到 70% 时，加入预先配制好的 0.1 、 0.2 、 0.3 、 0.4 、 0.5 、 1.0 μmol/L 的鱼藤酮工作液处理 12 、 24 、 48 h ，随后按 CCK-8 试剂盒操作说明检测各孔吸光度（ A ）值，计算细胞存活率，筛选出鱼藤酮的最适建模浓度及最佳建模时间。

  取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 2 × 104/ 孔接种于 96 孔板，待其融合度达到 70% 时，加入预先配制好的 2.5 、 5 、 10 、 20 、 40 、 60 μmol/L 的人参皂苷 Re 工作液处理 24 h ，随后按 CCK-8 试剂盒操作说明检测各孔 A 值，计算细胞存活率，筛选出人参皂苷 Re 的安全浓度。

  取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 2 × 104/ 孔接种于 96 孔板，待其融合度达到 70% 时，设置对照组、模型组、 L -DOPA （ 2.5 、 5 、 10 μmol/L ）组和人参皂苷 Re （ 2.5 、 5 μmol/L ）组，模型组和各给药组加入 0.3 μmol/L 鱼藤酮，各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，处理 24 h 。按 CCK-8 试剂盒操作说明检测各孔 A 值，计算细胞存活率。

  取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 4 × 104/ 孔接种于 6 孔板，待其融合度达到 70% 时，设置对照组、模型组、 L -DOPA （ 10 μmol/L ）组和人参皂苷 Re （ 2.5 、 5 μmol/L ）组，模型组和各给药组加入 0.3 μmol/L 鱼藤酮，各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，处理 24 h 。按细胞周期试剂盒操作说明加入 RNase/PI 染色工作液，通过 Amnis 流式细胞仪检测各组细胞在 G1 、 S 、 G2 期的含量分布。

  2.6.1 细胞线粒体压力测定 取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 2 × 104/ 孔接种于 XF 细胞培养板中，待其融合度达到 70% 时，按“ 2.4 ”项下方法分组并给药，弃去培养液，每孔加入 200 μL XF RPMI 培养液，弃去，反复清洗 3 次后加入 XF RPMI 培养液，使各孔终体积为 180 μL ，放于 37 ℃无 CO2 培养箱中静置 1 h ，随后按细胞线粒体压力测定试剂盒操作说明上机检测。

  2.6.2 细胞糖酵解速率测定 取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 2 × 104/ 孔接种于 XF 细胞培养板中，待其融合度达到 70% 时，按“ 2.4 ”项下方法分组并给药，弃去各孔培养液，每孔加入 200 μL XF RPMI 培养液，弃去，反复清洗 3 次后加入 XF RPMI 培养液，使各孔终体积为 180 μL ，放于 37 ℃无 CO2 培养箱中静置 1 h ，随后按细胞糖酵解测定试剂盒操作说明上机检测。

  2.7.2 细胞内 ROS 检测 取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 4 × 104/ 孔接种于 6 孔板，待其融合度达到 70% 时，按“ 2.4 ”项下方法分组并给药，按 ROS 试剂盒操作说明对各组细胞进行染色，通过荧光显微镜及流式细胞仪检测各组细胞 ROS 含量的变化。

  2.7.3 细胞内 ATP 含量检测 取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 4 × 104/ 孔接种于 6 孔板，待其融合度达到 70% 时，按“ 2.4 ”项下方法分组并给药，弃去培养基，按 ATP 检测试剂盒操作说明使用酶标仪检测细胞内 ATP 含量的变化。

  ）蛋白提取：取对数生长期的 SH-SY5Y 细胞以 4 × 104/ 孔接种于 6 孔板，待其融合度达到 70% 时，设置对照组、模型组和人参皂苷 Re （ 2.5 、 5 μmol/L ）组，模型组和各给药组加入 0.3 μmol/L 鱼藤酮，各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，处理 24 h 。弃去培养基，用 PBS 洗涤 1 遍，用胰蛋白酶消化细胞， 4 ℃、 1200 r/min 离心 5 min 收集细胞，弃上清， PBS 洗涤 2 次，按线粒体蛋白提取试剂盒说明书提取线粒体蛋白，按细胞白抽提试剂盒说明书提取细胞白。

  ）Western blotting 检测：采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，封闭后加入一抗， 4 ℃孵育过夜，次日 PBST 洗膜后加入二抗，室温孵育 2 h ， PBST 洗膜后加适量 ECL 荧光剂显影，分析条带灰度值。2.9 统计学分析

  数据以 表示，应用 GraphPad Prism 6 软件进行统计学分析，多组间差异分析应用 One-way ANOVA 分析方法中 LSD 分析，两组间差异分析应用 T 检验。

  如图 1 所示，与对照组比较， SH-SY5Y 细胞给予不同浓度的鱼藤酮处理 12 、 24 、 48 h 后，细胞存活率呈剂量和时间相关性地降低。 0.3 μmol/L 鱼藤酮处理 24 h 后，细胞存活率为（ 51.67 ± 4.22 ） % ，处理 48 h 与 24 h 相比，细胞存活率无显著性变化，因此选择 0.3 μmol/L 处理 24 h 作为鱼藤酮的最佳建模浓度及建模时间。

  安全浓度的确定及对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用如图 2 所示， SH-SY5Y 细胞给予不同浓度的人参皂苷 Re 处理后，当人参皂苷 Re 的浓度达到 10 μmol/L 时，细胞存活率显而易见地下降（ P ＜ 0.05 ），且呈剂量相关性，因此选择 2.5 、 5 μmol/L 的人参皂苷 Re 进行后续实验。 SH-SY5Y 细胞给予不同浓度的 L -dopa 处理后，当 L -DOPA 浓度达到 20 μmol/L 时，细胞存活率显而易见地下降（ P ＜ 0.05 ），且呈剂量相关性，因此选择 2.5 、 5 、 10 μmol/L L-DOPA 进行后续考察。

  SH-SY5Y 细胞经鱼藤酮诱导损伤后，细胞存活率显著下降（ P ＜ 0.01 ）；给予 2.5 、 5 μmol/L 人参皂苷 Re 或 5 、 10 μmol/L L-DOPA 处理后，细胞存活率明显上升（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），其中 5 μmol/L 人参皂苷 Re 与 10 μmol/L L-DOPA 作用效果相比无差异，由此可得出人参皂苷 Re 对鱼藤酮诱导的细胞毒性拥有非常良好的改善作用。

  对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞周期的影响如表 1 所示，与对照组比较，模型组 G0/G1 期细胞比例非常明显升高（ P ＜ 0.01 ）， S 期与 G2/M 期细胞比例明显降低（ P ＜ 0.01 ），表明鱼藤酮可诱导 SH-SY5Y 细胞出现非常明显的 G1 期阻滞作用；与模型组比较，各给药组 G0/G1 期细胞比例明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， S 期与 G2/M 期细胞比例非常明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），以 5 μmol/L 人参皂苷 Re 作用效果最显著，表明人参皂苷 Re 可显著缓解鱼藤酮诱导 SH-SY5Y 细胞周期的改变。

  对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响鱼藤酮可诱导细胞损伤，因此导致细胞发生 G0/G1 期阻滞，诱发细胞凋亡，因此接下来检测给药前后细胞凋亡的变化，如图 3 所示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率非常明显升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞凋亡率均显著下降（ P ＜ 0.01 ）。

  对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞糖酵解功能及线粒体氧化磷酸化功能的影响接下来对细胞糖酵解及线粒体氧化磷酸化功能进行仔细的检测，如图 4-A 、 C 所示，与对照组比较，模型组细胞内糖酵解 PER 值明显降低（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞内糖酵解 PER 值明显升高 （ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。如图 4-B 、 D 所示，与对照组比较，模型组细胞的最大呼吸能力、备用呼吸能力及 ATP 合成能力均明显降低（ P ＜ 0.01 ），质子漏明显地增加（ P ＜ 0.01 ），从而造成线粒体功能损伤；与模型组比较，各给药组细胞的最大呼吸能力、备用呼吸能力及 ATP 合成能力均明显地增强（ P ＜ 0.01 ），质子漏降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），其中以 5 μmol/L 人参皂苷 Re 作用效果最为显著。

  对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能紊乱的保护作用3.6.1 人参皂苷 Re 对细胞 MMP 的保护作用 接下来对线粒体功能进行一致性评价，首先检测 MMP 水平的变化，如图 5 所示，与对照组比较，模型组胞内 MMP 水平明显降低（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞内 MMP 明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），以 5 μmol/L 人参皂苷 Re 作用最为显著。

  3.6.2 人参皂苷 Re 对细胞内 ROS 生成的保护作用 ROS 诱导的氧化应激与线粒体功能紊乱紧密关联，并且 ROS 也是调控细胞凋亡的主要的因素之一。因此接下来检测细胞内 ROS 生成量的变化，如图 6 所示，与对照组比较，模型组细胞内 DCF 荧光强度非常明显升高（ P ＜ 0.01 ），胞内 ROS 生成量明显地增加（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞内DCF 荧光强度明显降低（P ＜0.05 、0.01 ），胞内ROS 生成量明显降低（P ＜0.05 、0.01 ），以5 μmol/L 人参皂苷Re 作用效果最为显著。

  3.6.3 人参皂苷 Re 对细胞内 ATP 含量的保护作用 接下来进一步检测线粒体功能的关键指标——胞内ATP 含量，如表2 所示，与对照组比较，模型组细胞内ATP 含量明显降低（P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组细胞内ATP 含量非常明显升高（P ＜0.05 、0.01 ），以5 μmol/L 人参皂苷Re 作用最为显著。

  和Pink-1蛋白表达Parkin 、 Pink-1 的异常表达与 PD 等神经性疾病的发展紧密关联，同时也在线粒体功能稳态的维护中起着至关重要的作用 [14] ，因此本研究从 Parkin 与 Pink-1 对线粒体功能稳态与 PD 之间的关系进行深入探讨，如图 7 所示，与对照组比较，模型组细胞内 Parkin 和 Pink-1 蛋白表达减少；与模型组比较，各给药组细胞内 Parkin 和 Pink-1 蛋白表达增强。

  3.8.2 人参皂苷 Re 对鱼藤酮诱导的 SH-SY5Y 细胞凋亡相关蛋白表达的影响 如图 9 所示，与对照组比较，模型组细胞线粒体内 Cyt-C 蛋白表达水平显著下调（ P ＜ 0.01 ），胞质中 Cyt-C 蛋白表达水平显著上调（ P ＜ 0.01 ）， Bcl-2 蛋白表达显著下调（ P ＜ 0.01 ）， Bax 和 cleaved Caspase-3 蛋白表达显著上调（ P ＜ 0.01 ），表明鱼藤酮可破坏细胞线粒体膜通透性，导致 Cyt-C 大量释放，造成线粒体功能紊乱，诱导凋亡蛋白 Bax 、 Bcl-2 、 cleaved Caspase-3 的异常表达；与模型组比较，给予人参皂苷 Re 处理后，可非常明显升高线粒体内 Cyt-C 蛋白表达（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），降低胞质中 Cyt-C 蛋白表达（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），降低 Bax 、 cleaved Caspase-3 的表达（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），上调 Bcl-2 的表达（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），表明人参皂苷 Re 可通过改变线粒体膜的通透性，抑制 Cyt-C 的释放，维护线粒体功能稳态，抑制细胞凋亡的发生。

  3.8.3 人参皂苷 Re 对鱼藤酮诱导的 SH-SY5Y 细胞 Nrf2 、 HO-1 、 GCLC 和 NQO1 蛋白表达的影响 人参皂苷 Re 对鱼藤酮诱导神经毒性的保护作用与线粒体稳态的维系紧密关联，线粒体是 ROS 产生的主要场所，当 ROS 含量较高时会发生氧化应激反应，氧化应激亦是诱导 PD 的主要病因之一，因此，针对人参皂苷 Re 的抗氧化作用进一步研究。如图 10 所示，与对照组比较，模型组细胞 HO-1 、 GCLC 及 NQO1 表达显著下调（ P ＜ 0.01 ）， Nrf2 核转移显著减少（ P ＜ 0.01 ）；给予人参皂苷 Re 处理后，细胞内 HO-1 、 GCLC 及 NQO1 表达显著上调（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， Nrf2 核转移显著增多（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。

  近年来，针对 PD 细胞模型的研究已慢慢的变成为焦点，常用其探索发病机制、了解药物作用靶点及研发新药等，目前常用于实验研究的细胞株有大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12 细胞系、SH-SY5Y 细胞系及原代中脑细胞系等。其中SH-SY5Y 细胞系具有人类成熟神经元的形态，与原代海马神经元相比更容易体外培养，因此被大范围的使用在中枢神经系统的体外模型研究[15-18] 。

  MPTP 可选择性地引起黑质致密部多巴胺能神经元损伤，成为第一个被证实有中枢DA 神经元毒性的外源性化学物质，但MPTP 在自然界中并不存在[19-23] ，鱼藤酮是一种线粒体复合物抑制剂，同时作为MPTP 的结构类似物，有着非常明显的神经毒性，也具有高度亲脂性，容易越过血脑屏障，不需要任何转运体即可进入多巴胺能神经元[24-27] 。因此本研究选用鱼藤酮作为化学诱导剂构建体外PD 模型，并从线粒体功能稳态与氧化应激等方面对机制进行深入研究。

  本研究结果为， SH-SY5Y 细胞经鱼藤酮诱导损伤后，细胞存活率显著下降，细胞凋亡率显著上升，细胞糖酵解能力及线粒体氧化磷酸化能力明显丧失，推测鱼藤酮可能通过破坏线粒体膜的通透性，导致MMP 下降，进而造成线粒体内ATP 合成障碍及线粒体膜转换孔异常打开，从而抑制细胞糖酵解能力及氧化磷酸化能力，诱导线粒体内Cyt-C 大量释放到细胞质，继而激活Caspase-3 信号通路，启动Caspase 级联反应，引起细胞凋亡，抑制神经细胞的生长；给予人参皂苷Re 处理后，上述PD 样病理症状均显著改善，推测人参皂苷Re 可能通过修复线粒体膜的通透性，抑制线粒体内Cyt-C 的释放，继而维护线粒体功能稳态，激活Kelch 样ECH 相关蛋白1 （Kelch like ECH associated protein 1 ，Keap1 ）-Nrf2- 抗氧化反应元件（antioxidant response element ，ARE ）信号通路，提高神经细胞的抗氧化活力，抑制线粒体介导的Caspase-3 凋亡信号通路，抑制神经元细胞凋亡，从而发挥神经保护作用（图11 ）。

  综上，本研究以线粒体功能稳态与氧化应激学说为切入点，利用化学诱导的方式建立 SH-SY5Y 细胞体外 PD 模型，充分模仿散发性 PD 的主要病因与病机，初步阐明了人参皂苷 Re 的神经保护作用机制及靶点，为进一步探索散发性 PD 的环境病因提供了全力支持，也为后续 PD 的中药治疗提供了宝贵的科学依据。

  来 源：赵文学，徐 燕，刘冬光，孟 雪，朱建国，姚 茹，姚景春，张贵民．人参皂苷Re对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞帕金森病模型的保护作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(11):3548-3558.

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